■ 知识点
His标签蛋白哺乳动物细胞
无血清培养表达和纯化
· 转染系统
随着生物制药和细胞治疗产品的需求不断增加，利用无血清细胞培养技术表达和纯化单克隆抗体及抗原等各种类型重组蛋白的技术已经得到越来越广泛的应用，新葡的京集团3512vip官网拥有完整的哺乳动物细胞无血清培养重组蛋白表达和纯化试剂及技术，可帮助客户实现各种重组蛋白的哺乳动物细胞无血清培养表达和纯化。
· 蛋白表达及纯化
重组蛋白的细胞表达需要先构建蛋白表达质粒，然后选择合适的细胞例如HEK293或CHO细胞，使用PEI等化学转染试剂或电转仪将质粒DNA导入细胞内来实现蛋白在细胞内的表达。
单克隆抗体的表达除了可以使用重组基因表达方法以外，还可以通过对杂交瘤细胞的无血清悬浮培养来获得高效表达。重组单克隆抗体及杂交瘤细胞单抗的纯化主要依靠蛋白A亲和层析实现，方法简单可靠，较少出现技术问题。
其它类型的重组蛋白纯化较多使用蛋白标签亲和层析法，通过在蛋白一端连接一段蛋白标签和使用标签蛋白特异结合填料来完成重组蛋白的纯化，其中His标签和相对应的镍填料层析可能最为常用。
· His标签蛋白
His标签蛋白组氨酸咪唑环可特异结合层析填料中的镍金属，并可利用咪唑竞争洗脱下来。His标签蛋白的纯化基本操作流程为：柱平衡、上样、洗杂、洗脱、柱再生。将样品调节至与平衡液相同的 pH，先后用5CV100%洗脱液及平衡液进行平衡，平衡完毕后进行上样。洗杂时可使用5%洗脱液进行竞争洗杂，洗去一些结合不牢的杂蛋白成分，再使用100%洗脱液将目的蛋白洗下收集，最后用5CV洗脱液及5CV平衡液再生柱子。
· 纯化His标签蛋白时较易出现各种技术问题
1.如果洗脱组分不纯，可增加洗杂液的体积、调节pH及咪唑浓度、增加一步纯化如离子交换疏水层析等。或对样品进行初步纯化如AS或PEI沉淀后再利用亲和层析完成纯化过程；
2.若洗脱组分中无目的蛋白或蛋白量过低，可通过Western Blotting方法对His标签蛋白表达和纯化样品进行定性和定量分析。如果蛋白表达量过低，则可尝试改变和优化表达条件来提高产量；如果蛋白表达量正常但是纯化效果不佳，则可尝试降低洗杂液浓度、提高洗脱液浓度以防止结合较弱或过强的目的蛋白的损失；
3.倘若上样过程中出现蛋白沉淀现象，则可能是操作温度太低，可以待样品恢复至室温后上样。也可考虑在样品或缓冲溶液中添加稳定剂。
纯化后的样品可通过SDS-PAGE凝胶电泳等方法对蛋白纯度及分子量进行测定。为了避免反复冻融对蛋白造成的影响可将纯化后的蛋白除菌后，分装成小份，按需取用，或使用冷冻干燥等方法将蛋白长期保存。
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